Spektrofotometri ir kļuvuši par parastiem instrumentiem mūsdienu molekulārās bioloģijas laboratorijās. Bieži izmanto nukleīnskābi, proteīnu kvantitatīvo noteikšanu un baktēriju augšanas koncentrāciju kvantitatīvo noteikšanu.
Vienkāršs spektrofotometra princips
Spektrofotometrs izmanto gaismas avotu, kas var radīt vairākus viļņu garumus, un iet caur virkni spektroskopisku ierīču, lai radītu gaismas avotu ar noteiktu viļņu garumu. Pēc tam, kad gaismas avots iziet cauri pārbaudāmajam paraugam, daļa gaismas avota tiek absorbēta, un aprēķina parauga absorbciju, tādējādi pārvēršoties parauga koncentrācijā. . Parauga absorbcija ir proporcionāla parauga koncentrācijai.
Nukleīnskābju kvantitatīva noteikšana
Nukleīnskābju kvantitatīvā noteikšana ir visbiežāk izmantotā spektrofotometra funkcija. Oligonukleotīdus, vienšķiedras, divslāņu DNS un RNS var noteikt buferī. Nukleīnskābes augstākās absorbcijas maksimuma absorbcijas maksimums ir 260 nm. Katras nukleīnskābes molekulārais sastāvs ir atšķirīgs, tāpēc konversijas koeficienti ir atšķirīgi. Lai noteiktu dažādu veidu nukleīnskābes, iepriekš atlasiet atbilstošos koeficientus. Piemēram, 1 OD absorbcija atbilst 50 μg / ml dsDNS, 37 μg / ml ssDNS, 40 μg / ml RNS un 30 μg / ml Olig. Absorbcija pēc testa tiek pārrēķināta ar iepriekš minētajiem koeficientiem, lai iegūtu atbilstošu parauga koncentrāciju. Pirms testēšanas izvēlieties pareizo procedūru, ievadiet izejas šķīduma un atšķaidītāja tilpumu un pēc tam pārbaudiet tukšo un parauga šķīdumu. Tomēr eksperiments ne vienmēr bija gluds. Nestabili rādījumi var būt eksperimenta lielākais galvassāpes. Instrumenti ar lielāku jutību liecina par lielāku absorbciju.
Faktiski spektrofotometra projektēšanas princips un darbības princips ļauj absorbcijai noteiktā diapazonā mainīties, ti, instrumentam ir noteikta precizitāte un precizitāte. Piemēram, Eppendorfa biofotometra precizitāte ir ≤1,0% (1A). Šādu vairāku pārbaužu rezultāti ir robežās no aptuveni 1,0% vidējā un ir normāli. Turklāt ir jāapsver arī pašas nukleīnskābes fizikāli ķīmiskās īpašības un bufera pH, kurā izšķīdina nukleīnskābi, jonu koncentrācija utt.: Ja jonu koncentrācija testa laikā ir pārāk augsta, nolasīšana, tāpēc ieteicams izmantot noteiktu pH vērtību un zemu jonu koncentrāciju. Buferi, piemēram, TE, ievērojami stabilizē rādījumus. Parauga atšķaidījuma koncentrācija ir arī faktors, ko nevar ignorēt: sakarā ar dažu smalku daļiņu, īpaši nukleīnskābes paraugu, neizbēgamu klātbūtni paraugā. Šo mazo daļiņu klātbūtne traucē testa rezultātiem. Lai samazinātu daļiņu ietekmi uz testa rezultātiem, nukleīnskābes absorbcijai jābūt vismaz lielākai par 0,1 A, un absorbcija ir vēlams no 0,1 līdz 1,5 A. daļiņas ir salīdzinoši nelielas un rezultāts ir stabils.
Tas nozīmē, ka parauga koncentrācijai nevajadzētu būt pārāk zemai vai pārāk augstai (ārpus fotometra testa diapazona). Visbeidzot, darbības faktoriem, piemēram, sajaukšanai, jābūt pietiekamiem, pretējā gadījumā absorbcijas vērtība ir pārāk zema, pat negatīvas vērtības; maisījums nevar pastāvēt burbuļi, tukšajam šķidrumam nav suspendētu vielu, pretējā gadījumā nolasīšana krasi; tukšā parauga un parauga pārbaudei jāizmanto tāda pati kivete. Pretējā gadījumā koncentrācijas starpība ir pārāk liela; konversijas koeficientu un parauga koncentrācijas vienību izvēlas konsekventi; nav iespējams izmantot kivi ar logu nodilumu; parauga tilpumam jāsasniedz minimālais tilpums, kas nepieciešams kivetē.
Papildus nukleīnskābes koncentrācijai spektrofotometrs arī parāda vairākas ļoti svarīgas attiecības, kas norāda parauga tīrību, piemēram, attiecības ar A 260 / A 280, ko izmanto, lai novērtētu parauga tīrību, jo proteīna absorbcijas maksimums ir 280 nm. Tīrs paraugs, kura attiecība ir lielāka par 1,8 (DNS) vai 2,0 (RNS). Ja attiecība ir zemāka par 1,8 vai 2,0, tā norāda uz olbaltumvielu vai fenola vielu klātbūtni. A 230 norāda, ka paraugā ir daži piesārņotāji, piemēram, ogļhidrāti, peptīdi, fenoli uc, un tīrākas nukleīnskābes A 260 / A 230 attiecība ir lielāka par 2,0. A 320 nosaka šķīduma duļķainību un citus traucējumu faktorus. Tīriem paraugiem A 320 parasti ir 0.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd.
Pievienot: No.168 Wuchang Ave., Yuhang rajons, Hangzhou 310023, Ķīna
TEL: + 86-571-88739859
Tālr .: +8618658504900
E-pasts: info@sumerlab.com
Tīmekļa vietne: sumerinstrument.com