Ievads spektrofotometra principu un vispārīgo komponentu lietošanā

Spektrofotometrs tiek plaši izmantots bioloģiskajos, ķīmiskajos, klīniskajos un vides pētījumos.
Spektrofotometrija mēra, cik daudz gaismas ķīmiskā viela var absorbēt, izlaižot gaismas staru caur paraugu spektrofotometrā.
Izmērot noteikto gaismas intensitāti, metodi var izmantot, lai noteiktu izšķīdušās vielas koncentrāciju paraugā.
Spektrofotometrijas jēdziens
Uz paraugu nosūtītais stars sastāv no fotonu stara.
Kad fotoni satiekas ar paraugā esošajām molekulām, molekulas var absorbēt dažus no tiem, samazināt fotonu skaitu starā un samazināt detektēšanas signāla intensitāti.
Caurlaidība ir gaismas daļa, kas iet caur paraugu. To definē kā gaismas intensitāti, kas iet caur paraugu pie krītošās gaismas intensitātes.
Absorbcija ir pretēja caurlaidībai, kas atbilst daudzumam, ko mēra ar spektrofotometru.
Atbilstoši absorbcijai šķīduma parauga koncentrāciju var noteikt pēc Lamberta likumprojekta, kas parāda, ka starp lineāro absorbciju un parauga koncentrāciju pastāv lineāra sakarība. Saskaņā ar alus Lamberta likumu absorbcija ir absorbcijas koeficienta produkts, kas ir gaismas daudzuma, ko absorbē šķīstošā viela noteiktā viļņa garumā, un attāluma, caur kuru gaisma iet, mērs. Paraugs vai pārvietošanās attālums un izšķīdinātā koncentrācija. Parasti absorbcijas mērīšanas mērķis ir izmērīt parauga koncentrāciju.
Spektrofotometra komponenti
Katru spektrofotometru veido gaismas avots, kolimators (objektīvs vai fokusēšanas ierīce spēcīgu un taisnu staru raidīšanai), monohromators dažādu viļņu garumu staru atdalīšanai un garuma selektors vēlamā viļņa garuma viļņa vai gropes izvēlei. Šajā video parādītajā spektrofotometrā izmantotā gaismas viļņa garums ir ultravioletās un redzamās gaismas diapazonā. Spektrofotometrs satur arī parauga turētāju, fotodetektoru un ekrānu, kurā parādīti detektora rezultāti.
Jaunākais spektrofotometrs ir tieši savienots ar datoru, kur var kontrolēt eksperimentālos parametrus un parādīt rezultātus.
Spektrofotometra darbības princips
Veicot spektrofotometriju, ir svarīgi ievērot atbilstošus piesardzības pasākumus, piemēram, valkāt cimdus, atkarībā no izmantotā bioloģiskā vai ķīmiskā šķīduma veida.
Pirms parauga UV-Vis spektra mērīšanas ieslēdziet ierīci un ļaujiet lampai un elektronikai uzkarst.
Sagatavo tukšo paraugu no tā paša šķīduma ar tādu pašu pH un līdzīgu jonu stiprumu, bet bez analizējamām sastāvdaļām; tā kā kivete un šķīdinātājs var izkliedēt gaismu, paraugs jāanalizē.
Tradicionālais spektrofotometra paraugu turētājs ir paredzēts plastmasas un kvarca trauku turēšanai. Ar pipeti oriģinālo šķīdumu bļodā.
Pēc pirkstu nospiedumu noslaukšanas un izšļakstīšanas bļodas ārpusē, pareizi ievietojiet kiveti parauga turētājā un aizveriet vāka durvis.
Nekad neaizmirstiet aizvērt durvis, jo ultravioletais starojums no atvērtā spektrofotometra var sabojāt acis un ādu.
Ieprogrammējiet vēlamo viļņa garumu vai viļņa garuma diapazonu, kas tiks pārsūtīts paraugam. Tas ir atkarīgs no labākā viļņa garuma, ko analizējamais komponents var absorbēt. Pēc tam mašīna tiek nullēta, izmērot tukšu paraugu, ar kuru parauga buferšķīduma dēļ tiek atņemta apakšējā absorbcija.
Atkarībā no spektrofotometrijas eksperimenta veida, kuru veicat, pirms parauga mērīšanas var būt nepieciešams ģenerēt standarta līkni, no kuras var noteikt analizētā savienojuma koncentrāciju paraugā.
Ļauj paraugam sasniegt pienācīgu temperatūru un viegli samaisa, lai neradītu burbuļus. Pēc tam paraugu var ievietot tieši bļodā mašīnas iekšpusē un var nolasīt.
Pēc tam, kad paraugam ir izmērīta absorbcija, eksperimentu pareizi aprēķina; piemēram, lai noteiktu koncentrāciju vai fermentu aktivitātes līmeni.
Spektrofotometra pielietojums
Viens no izplatītākajiem spektrofotometra lietojumiem ir šūnu blīvuma mērīšana. Šūnu blīvuma mērījumus var izmantot baktēriju logaritmiskās augšanas līknes iegūšanai, no kuras var noteikt optimālo laiku rekombinantā proteīna integrācijai.
Spektrofotometru var izmantot arī ķīmiskās reakcijas ātruma mērīšanai. Šajā iemiesojumā absorbciju izmanto, lai uzraudzītu fermentatīvo reakciju, kas ar laiku izzūd, izmantojot starpposma reakciju 452 nm. Šīs fermentatīvās pakāpes ātrumu var aprēķināt, saskaņojot datus ar atbilstošo vienādojumu.
Mikrospektrofotometra ieviešana novērš vajadzību pēc parauga turētāja. Šie spektrofotometri parauga uzturēšanai izmanto virsmas spraigumu.
Mikrospektrofotometrs ir labākā izvēle, lai izmērītu mazu un dārgu paraugu, piemēram, biomolekulu, ieskaitot olbaltumvielas un nukleīnskābes, masu un koncentrāciju.
Olbaltumvielu absorbcija pie 280 nm ir atkarīga no aromātisko sānu ķēžu satura, kas atrodama triptofānā, tirozīnā un fenilalanīnā, kā arī no disulfīdu saites starp abiem cisteīniem.
Olbaltumvielu koncentrāciju var noteikt pēc absorbcijas pie 280 nm un absorbcijas koeficienta, kura pamatā ir aminoskābju sastāvs.
DNS un RNS maksimālā absorbcija ir pie 260 nm, no kā var noteikt to koncentrāciju. Nukleīnskābju tīrību var novērtēt arī no absorbcijas nolasījumu attiecības pret konkrētiem viļņu garumiem.