Nukleīnskābju kvantitatīva noteikšana spektrofotometros
Nukleīnskābju kvantitatīva noteikšana ir spektrofotometra visbiežāk lietota funkcija . Oligonukleotīdus, vienas virknenes divšķautņainās DNS un RNS var kvantificēt buferos. Augstākās nukleīnskābes absorbcijas maksimuma absorbcijas maksimums ir 260 nm. Katrai nukleīnskābei ir atšķirīgs molekulārais sastāvs, un tāpēc tam ir dažādi konversijas koeficienti. Lai kvantificētu dažādu nukleīnskābju tipus, iepriekš izvēlieties atbilstošos koeficientus. Piemēram, 1OD absorbcija ir līdzvērtīga 50 μg / ml dsDNA, 37 μg / ml ssDNA, 40 μg / ml RNS un 30 μg / ml Olig, attiecīgi. Absorbcijas vērtību pēc testa konvertē ar iepriekš minēto koeficientu, lai iegūtu attiecīgo parauga koncentrāciju. Pirms testēšanas izvēlieties pareizo procedūru, ievadiet pamatšķīduma un šķīdinātāja daudzumus un pārbaudiet tukšo paraugu un parauga šķīdumus. Tomēr eksperiments nebija vienkāršs. Nestabilie rādījumi var būt eksperimentētāju lielākais galvassāpes. Jo augstāka ir instrumenta jutība, jo lielāka ir izstarotā absorbcijas novirze.
Faktiski spektrofotometra dizaina princips un darba princips ļauj absorbcijas vērtību mainīt noteiktā diapazonā, tas ir, instrumentam ir noteikta precizitāte un precizitāte. Piemēram, eppendorfa biofotometra precizitāte ≤ 1,0% (1A). Šo vairāku testu rezultāti atšķiras starp vidējo rādītāju 1,0% un visi ir normāli. Turklāt jāņem vērā arī nukleīnskābes fizikāli ķīmiskās īpašības, buferšķīduma pH nukleīnskābes izšķīdināšanai, jonu koncentrācijai utt. Testa laikā pārāk augsta jonu koncentrācija arī liek lasīt kā TE, kas ievērojami stabilizēs lasīšanu. Parauga atšķaidītā koncentrācija ir arī nenozīmīgs faktors: neizbēgamas parauga nelielu daļiņu klātbūtnes dēļ, jo īpaši nukleīnskābju paraugi. Šo mazo daļiņu klātbūtne traucē testa rezultātam. Lai samazinātu daļiņu ietekmi uz testa rezultātiem, nukleīnskābju absorbcija ir vismaz 0,1 A, un absorbcija ir vēlams 0,1-1,5 A. Šajā diapazonā nedrīkst būt burbuļi maisījums, un tukšajā šķīdumā nav suspensijas. Pretējā gadījumā nolasījumi strauji noiet; tukšā parauga un parauga pārbaudei jāizmanto tā pati kolorimetriskā kauss; pretējā gadījumā koncentrācijas starpība ir pārāk liela; konversijas koeficients un parauga koncentrācijas vienība ir vienādi; Kuveta, kas nēsā logs; parauga tilpumam ir jābūt lielākam par nepieciešamo minimālo krāsas kauss utt.
Papildus nukleīnskābes koncentrācijai spektrofotometrs, lai novērtētu parauga tīrību, vienlaicīgi parāda vairākas ļoti svarīgas attiecības, lai parauga tīrību, piemēram, A260 / A280, norāda parauga tīrības pakāpi, jo olbaltumvielu absorbcijas maksimums ir 280 nm. Tīru paraugu attiecība ir lielāka par 1,8 (DNS) vai 2,0 (RNS). Ja attiecība ir mazāka par 1,8 vai 2,0, tas norāda uz olbaltumvielu vai fenola vielu klātbūtni. A230 norāda, ka paraugā ir daži piesārņotāji, piemēram, ogļhidrāti, peptīdi, fenoli utt. Tīrās nukleīnskābes A260 / A230 attiecība ir lielāka par 2,0. A320 nosaka šķīduma duļķainumu un citus traucējumu faktorus. Pure paraugs, A320 parasti ir 0.
Kompānija specializējas spektrofotometru pārdošanā, laipni klienti, kuriem ir nepieciešams konsultēties un iegādāties, mēs nodrošināsim jums patiesu pakalpojumu un kvalitatīvus produktus, kā arī zemākas cenas.
E-pasts: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com